enzymatiska återvinningsmetod, för GSH , använder glutationreduktas att kvantifiera GSH . Detta protokoll är specifikt för plasma , vävnad eller odlade cellprover . Lägg reagenset DTNB ( 5 -5'- ditio-bis - 2 -nitrobensoesyra ) till GSH . Sulfhydrylgruppen i GSH reagerar med reagenset och ger en gul syra som kallas 5 -tio- 2 -nitrobensoesyra ( TNB ) . Lägg glutationreduktas till syran och GSH blandning att återvinna GSH och producerar mer syra . I detta förfarande , är graden av syraproduktionen i proportion till återvinnings reaktion GSH; därför mäts absorbansen för TNB syra med användning av en spektrofotometer. Absorbansen ger en uppskattning av den verkliga mängden GSH i provet .
Lever Cell Glutathione Assay
protokoll analyserar mängden GSH i mänsklig hepatokarcinom ( levercancer ) celler. För att genomföra den här proceduren , använd den kolorimetriska metoden för GSH beslutsamhet att minska och oxidera GSH . Minska GSH med användning 5 -5' -ditiobis ( 2 -nitrobensoesyra eller DTNB ) för att bilda
färgad produkt 2 -nitro- 5 - tiobensoesyra och oxiderat glutation ( GSSG ) . Använd glutationreduktas att minska GSSG att bilda GSH igen. För att mäta mängden av GSH i levercellerna , läsa provet vid 415 absorbans kinetiskt på en mikroplattläsare .
Cell apoptos
detta protokoll är GSH används för att upptäcka cell apoptos ( död ) genom mätning av minskningen i reducerad GSH . En minskning av koncentrationen av cellulära GSH är en indikator på celldöd. Färga provceller med icke- fluorescerande thiolite grönt. Den thiolite grön ackumuleras i cytosolen (cell plasma) och mitokondrier ( kraftpaket ) av cellen. Använd en flödescytometer på 490/520 nanometer för att visualisera mängden GSH i cellerna .
Totala koncentrationen av GSH i djur-och växt Prover
mäta koncentrationen av totala GSH i både reducerad och oxiderad form i olika djur-och växtprover. Lägg den allmänna tiol -reagens, 5 -5'- ditiobis [ 2 -nitrobensoesyra ] . Den tiolreagens reagerar med GSH att bilda 412 nm kromofor , 5 - thionitrobenzoic syra ( TNB ) och GS - TNB . Lägg glutationreduktas och Beta - nikotinamidadenindinukleotidfosfat ( NADPH ) för att minska GS - TNB . Den glutation kommer också att släppa en andra TMB molekyl och återvinna GSH . Dessutom är varje oxiderad GSH ( GSSG ) i blandningen fromed från disulfid reaktionen också reduceras till GSH . Använd en mikroplattläsare vid 405 nanometer för att läsa absorbansnivå och ange den totala koncentrationen av GSH . Addera