Hur man använder Sanger reagenser

är Sanger reagens som används för att bestämma sekvensen av aminosyror som bygger upp en peptid . Reagensen kommer att låsa på eller - tag - aminosyran vid slutet av en peptidkedja , även känd som N-terminalen . Peptiden kan sedan brytas i bitar ( hydrolyseras ) och de enskilda aminosyrorna undersöktes med användning av olika kromatografiska metoder. Oavsett vilken aminosyra bär taggen är en i slutet . Sangers reagens är också känd som dinitrofluorbensen ( DNFB ) . När den har hakade på en aminosyra , är det kallas en DNP - compound.Things du behöver
laboratorium skala
Handskar
Skyddsglasögon
Centrifug
Centrifugrör
Pasteur- pipetter
Destillerat vatten
4,2 % lösning av natriumbikarbonat
Sangers Reagent ( FDNB ) katalog pH papper
Dietyleter
6M lösning av saltsyra
Aceton
Test tub
Visa fler Instruktioner
1

Väg upp 3 miligrams av peptid på en skala . Lägg den i ett centrifugrör . Tillsätt cirka 0,3 ml vatten, 0,3 ml av Sangers reagens och 0,075 ml natriumbikarbonat.
2

Tillåt centrifugröret för att inkubera vid rumstemperatur under en timme. Under inkuberingen , skaka röret försiktigt för att hindra blandningen från att separera . Kontrollera lösningens pH var 15 minuter med pH-papper. PH-värdet bör hållas över 9 . Om det börjar att släppa , lägga till en liten mängd natriumbikarbonat ( ca en droppe med pasteurpipett ) . Addera 3

Efter inkubation till 1.5 ml vatten, och en lika stor mängd eter. Låt lösningen separera i skikt. Du kan behöva att centrifugera blandningen för att separera det . Ta eterfasen ( överst , gul lager ) med en pipett och kassera den .
4

Justera pH ned till 1,0 genom långsam tillsats av saltsyra . Lägg lite syra i taget , rör om försiktigt , sedan kontrollera pH med pH-papper . Sammantaget bör det kräva omkring 0,15 ml av syra. Om pH sjunker under 1,0 , tillsätt en liten mängd ( inte mer än en droppe ) natriumbikarbonat .
5

Tillsätt 3 ml eter . Låt blandningen separera. Nu det översta lagret ( det gula , eterskiktet ) innehåller din DNP - förening . Med pipett försiktigt extrahera detta skikt och överföra den till ett rent provrör . Placera provröret åt sidan och låta vätskan förångas och lämnar efter sig en torr, gul fast substans.
6

Tvätta fast material med aceton. Lägg till 0.3 mililiters aceton , rör om försiktigt och extrahera vätskan med en pipett . Addera 0,75 mililiters av syra till provröret . Din peptid är nu taggad och redo att hydrolyseras och analyseras med kromatografi metod som du väljer . Addera