Hur man förbereder en droppe

För att bestämma 3D-strukturen av ett protein , behöver du först en ren kristall av den. Den hängande -släpp metoden använder en droppe proteininnehållande lösningen hängande från ett täckglas . Under denna hängande droppe ligger en reservoar med en högre saltkoncentration än den nedgång . Över tiden , vattenånga lämnar droppe och hamnar i behållaren , vilket gör att proteinet att kristallisera. Varje protein kräver olika förhållanden ( t.ex. saltkoncentration och pH ) , och ofta rättegång och fel är det enda sättet att hitta rätt conditions.Things Du behöver
Laboratorierock , handskar och skyddsglasögon
Mikropipett med pipett tips
1 molar lösning av natriumklorid i 0,05 molar acetatbuffert , pH 4,7
2 ml Eppendorf-rör (eller liknande ) katalog Centrifugera
24 -brunnar
Vakuumfetti sprutan
silikoniserade täck
Trycklufts
pincett
Clay (t.ex. modellera eller liknande )
50 mg /ml lysozym i 0,05 molar acetatbuffertlösning , pH 4,7
Visa fler Instruktioner
vid 1

Sätt på lab växel ( rock , handskar och skyddsglasögon ) . köpa 2

Använd en mikropipett för att lägga till 1,1 ml av en natriumklorid ( salt) och acetatbuffertlösning in ett Eppendorf-rör .
3

Centrifugera den slutna Eppendorf-rör med saltlösningen inuti den i ca fem minuter vid 13.000 rpm. Kom ihåg att balansera centrifugen genom att placera ett annat Eppendorf-rör innehållande 1,1 ml vatten över från och motsatt till saltlösningen röret.
4

Lägg 1 ml av saltlösningen till en brunn i en 24 -brunnars plattan .
5

Använd en fettfylldspruta för att placera ett tunt lager fett runt kanten av denna brunn. Se till att inte lägga för lite eller för mycket . Om du lägger för mycket fett , kommer fettet rinna ner i brunnen och eventuellt förstöra experimentet . Om du använder för lite , kommer väl inte vara lufttät och experimentet kommer inte att fungera . Sikta bara tillräckligt fett som täck och fett bildar en lufttät tätning senare.
6

Rulla leran med händerna för att göra fyra små bollar , och skjut dem på de fyra hörnen av 24- brunnsplatta . De kommer att fungera som stöd för att säkerställa skyddet av plattan inte kommer i kontakt med täckglas .
7

Använd tryckluft för att blåsa bort damm bort av täckglas . Håll täckglas med ett par rena pincett .
8

Suck upp 4 mikroliter av lysozymlösningen med mikropipett , och lägga denna lösning till mitten av täckglas . Byt pipettspetsar och tillsätt 4 mikroliter av saltlösningen. Pipettera försiktigt upp och ned , suger in vätska sedan utvisa det, att blanda saltlösningen med lysozym -lösning. Var noga med att blanda två utan dispergering vätskan över hela täckglaset.
9

Vrid täck över snabbt så att vätskan inte glider av och plantera det rakt ovanpå brunnen . Var noga med att trycka försiktigt på den så den bildar en lufttät tätning med fettet runt kanterna på brunnen .
10

Skjut locket på 24 -brunnar på lera bollar, och lämna plattan på en sval plats . Addera