Hur kalibrerar gelfiltreringskolonner

gelfiltreringskolonner används för att separera proteiner från komplexa blandningar . Eftersom varje protein som har en unik molekylvikt , de kan induceras till att separera i distinkta skikt genom att migrera dem genom en filtreringskolonn innehållande en jämnt fördelad gelmatris . För att korrekt identifiera varje protein som separeras ut , måste du kalibrera kolumnerna med hjälp av flera proteiner med känd molekyl weight.Things Du behöver
Kolsyreanhydraslösning
cytokrom C
Aprotinin
Basal salt
Centrifugrör
Ferritin
Centrifug
Pipet pump
250 ml mätglas
buffert vätska
Vetenskaplig rengöringsdukar
Syringe fat
Visa fler Instruktioner

1

Avlägsna rören av karbanhydras , cytokrom C och aprotinin från kylen eller frysen och låt dem uppnå rumstemperatur . Lägg till 4 mg av varje protein till ett centrifugrör per ml gel i filtreringskolonn . Lägg 961 mel av basala salt per milligram protein till varje centrifugrör att upplösa proteiner . Lägg 39,2 mel av ferritin per ml gel till varje rör och blanda sedan i en centrifug .
2

Stäng av filtreringskolonn pumpen och stänga avstängningskranen vid kolonnens ingång. Skruva , men inte ta bort, den övre delen av filtreringskolonn . Ställ in pumpen till den maximala flödeshastigheten för kolumnen och starta pumpen tills buffertmaterialet har tagits bort . Stoppa pumpen . Addera 3

Tillsätt 1 ml varje protein till filtreringskolonnmed hjälp av en pipett pump . Droppa proteinerna ner på insidan av kolonnen från en höjd av 1 cm till 2 cm , som arbetar i närheten av den inre kanten av kolonnen. Tillåt proteinblandningen sedimentera ovanpå gelmatrisen .
4

Placera utloppsslangen på pumpen i en ren, torr 250 ml mätcylinder. Starta om pumpen med en hastighet av 0,30 ml per minut och kör proteinerna in i gelmatrisen . Medan pumpen går , skölj de sidor av röret med hjälp av pipett pump och en liten mängd av buffertvätska . När proteinerna har helt kommit in i gelmatrisen , minska pumphastigheten till 0,02 ml per minut och pumpen på en 5 cm till 7 cm skikt av buffertvätskan på toppen av matrisen.
5

Koppla bort kolumnen mössa från kranen . Rengör kolonnen locket och insidan av kolonnen med hjälp av vetenskapliga rengöringsdukar . Installera kolonnen cap. Fyll buffertreservoaren med buffertvätska . Fäst en sprutcylinder till kranen och öppna den. Använd sprutan för att dra en liten mängd av buffert genom slangen och in i sprutan. Stäng kranen och sätta tillbaka den till den övre delen av kolonnen . Öppna vattenkranen och kontrollera tätheten .
6

Kör kolonnen med 0,02 ml per minut i flera dagar , tills ferritin bandet närmar sig slutet av kolonnen . Samla alla filtrerings gel som pumpas ut i den graderade cylindern . Addera